Ang kamandag ng ahas ay naglalaman ng mga enzyme na nag-hydrolyze ng mga bono ng carboxyl ester.Ang mga substrate para sa hydrolysis ay phospholipids, acetylcholine at aromatic acetate.Kasama sa mga enzyme na ito ang tatlong uri: phospholipase, acetylcholinesterase at aromatic esterase.Ang arginine esterase sa kamandag ng ahas ay maaari ring mag-hydrolyze ng sintetikong arginine o lysine, ngunit higit sa lahat ay nag-hydrolyze ito ng mga peptide bond ng protina sa kalikasan, kaya kabilang ito sa protease.Ang mga enzyme na tinalakay dito ay kumikilos lamang sa mga substrate ng ester at hindi maaaring kumilos sa anumang peptide bond.Sa mga enzyme na ito, ang mga biological function ng acetylcholinesterase at phospholipase ay mas mahalaga at ganap na pinag-aralan.Ang ilang mga kamandag ng ahas ay may malakas na aktibidad ng aromatic esterase, na maaaring mag-hydrolyze ng p-nitrophenyl ethyl ester, a – o P-naphthalene acetate at indole ethyl ester.Hindi pa rin alam kung ang aktibidad na ito ay ginawa ng isang independiyenteng enzyme o isang kilalang side effect ng carboxylesterase, pabayaan ang biological na kahalagahan nito.Kapag ang lason ng Agkistrodon halys Japonicus ay na-react sa p-nitrophenyl ethyl ester at indole ethyl ester, ang hydrolysates ng p-nitrophenol at indole phenol ay hindi natagpuan;Sa kabaligtaran, kung ang mga ester na ito ay tumutugon sa cobra Zhoushan subspecies snake venom at Bungarus multicinctus snake venom, mabilis silang ma-hydrolyzed.Ito ay kilala na ang mga cobra venom na ito ay may malakas na aktibidad ng cholinesterase, na maaaring responsable para sa hydrolysis ng mga substrate sa itaas.Sa katunayan, Mclean et al.(1971) ay nag-ulat na maraming mga kamandag ng ahas na kabilang sa pamilyang Cobra ang maaaring mag-hydrolyze ng indole ethyl ester, naphthalene ethyl ester at butyl naphthalene ester.Ang mga kamandag ng ahas na ito ay nagmula sa: cobra, black neck cobra, black lipped cobra, golden cobra, Egyptian cobra, king cobra, golden cobra mamba, black mamba at white lipped mamba (alam pa rin ni D. aw ang eastern rhombola rattlesnake
Ang kamandag ng ahas ay maaaring mag-hydrolyze ng methyl indole ethyl ester, na siyang substrate para sa pagtukoy ng aktibidad ng cholinesterase sa serum, ngunit ang kamandag ng ahas na ito ay hindi nagpapakita ng aktibidad ng cholinesterase.Ito ay nagpapakita na mayroong hindi kilalang esterase sa cobra venom, na iba sa cholinesterase.Upang maunawaan ang likas na katangian ng enzyme na ito, kailangan ang karagdagang trabaho sa paghihiwalay.
1, Phospholipase A2
(I) Pangkalahatang-ideya
Ang Phospholipase ay isang enzyme na maaaring mag-hydrolyze ng glyceryl phosphate.Mayroong 5 uri ng phospholipase sa kalikasan, katulad ng phospholipase A2 at phospholipase
A. , phospholipase B, phospholipase C at phospholipase D. Ang kamandag ng ahas ay pangunahing naglalaman ng phospholipase A2 (PLA2), ang ilang mga kamandag ng ahas ay naglalaman ng phospholipase B, at iba pang mga phospholipase ay pangunahing matatagpuan sa mga tisyu at bakterya ng hayop.Ipinapakita ng Fig. 3-11-4 ang action site ng mga phospholipases na ito sa substrate hydrolysis.
Sa mga phospholipases, ang PLA2 ay higit na pinag-aralan.Maaaring ito ang pinaka-pinag-aralan na enzyme sa kamandag ng ahas.Ang substrate nito ay ang ester bond sa pangalawang posisyon ng Sn-3-glycerophosphate.Ang enzyme na ito ay malawak na matatagpuan sa snake venom, bee venom, scorpion venom at tissue ng hayop, at ang PLA2 ay sagana sa apat na family snake venoms.Dahil sinisira ng enzyme na ito ang mga pulang selula ng dugo at nagiging sanhi ng hemolysis, tinatawag din itong "hemolysin".Tinatawag din ng ilang tao ang PLA2 hemolytic lecithinase.
Unang natagpuan ng Ludeeke na ang kamandag ng ahas ay maaaring makagawa ng isang hemolytic compound sa pamamagitan ng pagkilos sa lecithin sa pamamagitan ng mga enzyme.Nang maglaon, si Delezenne et al.napatunayan na kapag ang kamandag ng cobra ay kumikilos sa serum o yolk ng kabayo, ito ay bumubuo ng isang hemolytic substance.Alam na ngayon na ang PLA2 ay maaaring direktang kumilos sa mga phospholipid ng erythrocyte membrane, sinisira ang istraktura ng erythrocyte membrane at nagiging sanhi ng direktang hemolysis;Maaari din itong kumilos sa serum o idinagdag na lecithin upang makagawa ng hemolytic lecithin, na kumikilos sa mga pulang selula ng dugo upang makagawa ng hindi direktang hemolysis.Bagama't sagana ang PLA2 sa apat na pamilya ng mga kamandag ng ahas, bahagyang naiiba ang nilalaman ng mga enzyme sa iba't ibang kamandag ng ahas.Rattlesnake (C
Ang kamandag ng ahas ay nagpakita lamang ng mahinang aktibidad ng PLA2.Ang talahanayan 3-11-11 ay naglalarawan ng paghahambing ng aktibidad ng PLA2 ng 10 pangunahing lason ng makamandag na ahas sa China.
Talahanayan 3-11-11 Paghahambing ng mga aktibidad ng phospholipase VIII ng 10 kamandag ng ahas sa China
Lason ng ahas
Paglabas ng taba
Aliphatic acid,
Cjumol/mg)
Hemolytic activity CHU50/^ g * ml)
Lason ng ahas
Ilabas ang mga fatty acid
(^raol/mg)
Hemolytic na aktibidad "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
labing-isa
Micracephal ophis
limang punto isang zero
kalyspallas
8. 68
dalawang libo at walong daan
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tatlong punto walo dalawa
isang daan at apatnapu
Bnugarus fasctatus
7,56
dalawang daan at walumpu
B. multicinctus
isang punto siyam anim
dalawang daan at walumpu
Viper at russelli
pitong punto zero tatlo
T, mucrosquamatus
isang punto walo lima
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Paghihiwalay at paglilinis
Ang nilalaman ng PLA2 sa kamandag ng ahas ay malaki, at ito ay matatag sa init, acid, alkali at denaturant, upang madali itong linisin at paghiwalayin ang PLA2.Ang karaniwang paraan ay ang unang pagsasala ng gel sa kamandag na krudo, pagkatapos ay isagawa ang chromatography ng pagpapalitan ng ion, at ang susunod na hakbang ay maaaring ulitin.Dapat pansinin na ang freeze-drying ng PLA2 pagkatapos ng ion-exchange chromatography ay hindi dapat maging sanhi ng pagsasama-sama, dahil ang proseso ng freeze-drying ay madalas na nagpapataas ng lakas ng ionic sa system, na isang mahalagang kadahilanan na nagiging sanhi ng pagsasama-sama ng PLA2.Bilang karagdagan sa mga pangkalahatang pamamaraan sa itaas, ang mga sumusunod na pamamaraan ay pinagtibay din: ① Wells et al.② Ang substrate analogue ng PLA2 ay ginamit bilang ligand para sa affinity chromatography.Ang ligand na ito ay maaaring magbigkis sa PLA2 sa kamandag ng ahas na may Ca2+.Ang EDTA ay kadalasang ginagamit bilang eluent.Pagkatapos alisin ang Ca2+, bumababa ang affinity sa pagitan ng PLA2 at ligand, at maaari itong ihiwalay sa ligand.Ang iba ay gumagamit ng 30% organic solution o 6mol/L urea bilang eluent.③ Ang hydrophobic chromatography ay isinagawa gamit ang PheiiylSephar0SeCL-4B upang alisin ang bakas na PLA2 sa cardiotoxin.④ Ginamit ang anti PLA2 antibody bilang ligand para magsagawa ng affinity chromatography sa PLA2.
Sa ngayon, isang malaking bilang ng kamandag ng ahas na PLAZ ang nalinis.Tu et al.(1977) nakalista ang PLA2 na nalinis mula sa kamandag ng ahas bago ang 1975. Sa mga nagdaang taon, maraming mga artikulo tungkol sa paghihiwalay at paglilinis ng PLA2 ang naiulat bawat taon.Dito, nakatuon kami sa paghihiwalay at paglilinis ng PLA ng mga iskolar ng Tsino.
Chen Yuancong et al.(1981) ay naghiwalay ng tatlong uri ng PLA2 mula sa kamandag ng Agkistrodon halys Pallas sa Zhejiang, na maaaring nahahati sa acidic, neutral at alkaline na PLA2 ayon sa kanilang mga isoelectric na puntos.Ayon sa toxicity nito, ang neutral na PLA2 ay mas nakakalason, na kinilala bilang presynaptic neurotoxin Agkistrodotoxin.Ang alkaline PLA2 ay hindi gaanong nakakalason, at ang acidic na PLA2 ay halos walang toxicity.Wu Xiangfu et al.(1984) inihambing ang mga katangian ng tatlong PLA2s, kabilang ang molecular weight, amino acid composition, N-terminal, isoelectric point, thermal stability, enzyme activity, toxicity at hemolytic activity.Ang mga resulta ay nagpakita na sila ay may katulad na molekular na timbang at thermal stability, ngunit may makabuluhang pagkakaiba sa iba pang mga aspeto.Sa aspeto ng aktibidad ng enzyme, ang aktibidad ng acid enzyme ay mas mataas kaysa sa aktibidad ng alkaline na enzyme;Ang hemolytic na epekto ng alkaline enzyme sa mga pulang selula ng dugo ng daga ang pinakamalakas, na sinusundan ng neutral na enzyme, at ang acid enzyme ay halos hindi na hemolyzed.Samakatuwid, pinaniniwalaan na ang hemolytic effect ng PLAZ ay nauugnay sa singil ng molekula ng PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) ay gumawa ng mga kristal na Agkistrodotoxin.Tu Guangliang et al.(1983) ay nag-ulat na ang isang nakakalason na PLA na may isoelectric point na 7. 6 ay nahiwalay at nalinis mula sa kamandag ng Vipera rotundus mula sa Fujian, at ang pisikal at kemikal na mga katangian nito, komposisyon ng amino acid at ang pagkakasunud-sunod ng 22 amino acid residues sa N -natukoy ang terminal.Li Yuesheng et al.(1985) ay naghiwalay at naglinis ng isa pang PLA2 mula sa kamandag ng Viper rotundus sa Fujian.Ang subunit ng PLA2 * ay 13 800, ang isoelectric point ay 10.4, at ang partikular na aktibidad ay 35/xnioI/miri mg。 Sa lecithin bilang substrate, ang pinakamainam na pH ng enzyme ay 8.0 at ang pinakamainam na temperatura ay 65 ° C LD5 iniksyon sa ugat sa mga daga.Ito ay 0.5 ± 0.12mg/kg.Ang enzyme na ito ay may halatang anticoagulant at hemolytic effect.Ang nakakalason na molekula ng PLA2 ay binubuo ng 123 nalalabi ng 18 uri ng mga amino acid.Ang molekula ay mayaman sa cysteine (14), aspartic acid (14) at glycine (12), ngunit naglalaman lamang ng isang methionine, at ang N-terminal nito ay serine residue.Kung ikukumpara sa PLA2 na nakahiwalay ng Tuguang, ang bigat ng molekular at ang bilang ng mga residue ng amino acid ng dalawang isoenzymes ay halos magkapareho, at ang komposisyon ng amino acid ay halos magkapareho, ngunit ang bilang ng mga residue ng aspartic acid at proline ay medyo naiiba.Ang Guangxi king cobra snake venom ay naglalaman ng mayaman na PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) ihiwalay ang isang PLA2 mula sa kamandag, na may isang tiyak na aktibidad na 3.6 beses na mas mataas kaysa sa orihinal na lason, isang molekular na timbang na 13000, isang komposisyon ng 122 amino acid residues, isang isoelectric point na 8.9, at mahusay na thermal stability.Mula sa obserbasyon ng mikroskopyo ng elektron ng epekto ng pangunahing PLA2 sa mga pulang selula ng dugo, makikita na ito ay may halatang epekto sa lamad ng pulang selula ng dugo ng tao, ngunit walang malinaw na epekto sa mga pulang selula ng dugo ng kambing.Ang PLA2 na ito ay may halatang retardation effect sa electrophoretic na bilis ng mga pulang selula ng dugo sa mga tao, kambing, kuneho at guinea pig.Chen et al.Maaaring pigilan ng enzyme na ito ang pagsasama-sama ng platelet na dulot ng ADP, collagen at sodium arachidonic acid.Kapag ang konsentrasyon ng PLA2 ay 10/xg/ml~lOOjug/ml, ganap na napipigilan ang pagsasama-sama ng platelet.Kung ang mga hugasan na platelet ay ginamit bilang mga materyales, hindi maaaring pigilan ng PLA2 ang pagsasama-sama sa konsentrasyon ng 20Mg/ml.Ang aspirin ay isang inhibitor ng cyclooxygenase, na maaaring makapigil sa epekto ng PLA2 sa mga platelet.Maaaring pigilan ng PLA2 ang pagsasama-sama ng platelet sa pamamagitan ng hydrolyzing arachidonic acid upang ma-synthesize ang thromboxane A2.Ang conformation ng solusyon ng PLA2 na ginawa ng Agkistrodon halys Pallas venom sa Zhejiang Province ay pinag-aralan sa pamamagitan ng circular dichroism, fluorescence at UV absorption.Ang mga eksperimentong resulta ay nagpakita na ang pangunahing chain conformation ng enzyme na ito ay katulad ng sa parehong uri ng enzyme mula sa iba pang mga species at genera, ang skeleton conformation ay may magandang heat resistance, at ang structural change sa acid environment ay nababaligtad.Ang kumbinasyon ng activator Ca2+ at enzyme ay hindi nakakaapekto sa kapaligiran ng mga residue ng tryptophan, habang ang inhibitor na Zn2+ ay kabaligtaran.Ang paraan kung saan ang halaga ng pH ng solusyon ay nakakaapekto sa aktibidad ng enzyme ay naiiba sa mga reagents sa itaas.
Sa proseso ng PLA2 purification ng snake venom, isang halatang phenomenon ay ang snake venom ay naglalaman ng dalawa o higit pang PLA2 elution peak.Ang hindi pangkaraniwang bagay na ito ay maaaring ipaliwanag tulad ng sumusunod: ① dahil sa pagkakaroon ng isozymes;② Ang isang uri ng PLA2 ay polymerized sa iba't ibang mga PLA2 mixtures na may iba't ibang molecular weight, karamihan sa mga ito ay nasa hanay na 9,000~40,000;③ Ang kumbinasyon ng PLA2 at iba pang bahagi ng kamandag ng ahas ay nagpapalubha sa PLA2;④ Dahil ang amide bond sa PLA2 ay hydrolyzed, nagbabago ang singil.① At ② ay karaniwan, na may ilang mga pagbubukod lamang, tulad ng PLA2 sa CrWa/w snake venom
Mayroong dalawang sitwasyon: ① at ②.Ang ikatlong kondisyon ay natagpuan sa PLA2 sa lason ng mga sumusunod na ahas: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Palestinian viper, sand viper, at kakila-kilabot na rattlesnake km.
Ang resulta ng case ④ ay nagpapabago sa bilis ng paglipat ng PLA2 sa panahon ng electrophoresis, ngunit hindi nagbabago ang komposisyon ng amino acid.Maaaring masira ang mga peptide sa pamamagitan ng hydrolysis, ngunit sa pangkalahatan ay pinagsasama-sama pa rin sila ng mga bono ng disulfide.Ang lason ng eastern pit rattlesnake ay naglalaman ng dalawang anyo ng PLA2, na tinatawag na type a at type p PLA2 ayon sa pagkakabanggit.Ang pagkakaiba sa pagitan ng dalawang uri ng PLA2 na ito ay isang amino acid lamang, iyon ay, ang glutamine sa isang molekula ng PLA2 ay pinalitan ng glutamic acid sa isa pang molekula ng PLA2.Bagaman hindi malinaw ang eksaktong dahilan para sa pagkakaibang ito, karaniwang pinaniniwalaan na ito ay nauugnay sa deamination ng PLA2.Kung ang PLA2 sa Palestinian viper venom ay pinananatiling mainit kasama ng crude venom, ang mga end group sa mga enzyme molecule nito ay magiging higit pa kaysa dati.Mula sa C PLA2 na nakahiwalay sa kamandag ng ahas ay may dalawang magkaibang N-terminal, at ang molecular weight nito ay 30000. Ang phenomenon na ito ay maaaring sanhi ng asymmetric dimer ng PLA2, na katulad ng simetriko dimer na nabuo ng PLA2 sa lason ng eastern diamondback rattlesnake. at western diamondback rattlesnake.Ang Asian cobra ay binubuo ng maraming subspecies, ang ilan sa mga ito ay hindi masyadong tiyak sa klasipikasyon.Halimbawa, ang dating tinatawag na Cobra Outer Caspian subspecies ay kinikilala na ngayon
Dapat itong maiugnay sa Outer Caspian Sea Cobra.Dahil maraming mga subspecies at pinaghalo ang mga ito, ang komposisyon ng kamandag ng ahas ay lubhang nag-iiba dahil sa iba't ibang mga mapagkukunan, at ang nilalaman ng PLA2 isozymes ay mataas din.Halimbawa, kamandag ng cobra
Hindi bababa sa 9 na uri ng PLA2 isozymes ng r ^ ll species ang natagpuan sa, at 7 uri ng PLA2 isozymes ang natagpuan sa lason ng cobra subspecies na Caspian.Durkin et al.(1981) pinag-aralan ang nilalaman ng PLA2 at ang bilang ng mga isozyme sa iba't ibang kamandag ng ahas, kabilang ang 18 kamandag ng kobra, 3 kamandag ng mamba, 5 kamandag ng ulupong, 16 na kamandag ng ahas at 3 kamandag ng ahas sa dagat.Sa pangkalahatan, mataas ang aktibidad ng PLA2 ng cobra venom, na may maraming isozymes.Ang aktibidad ng PLA2 at isozymes ng viper venom ay daluyan.Ang aktibidad ng PLA2 ng mamba venom at rattlesnake venom ay napakababa o walang aktibidad ng PLA2.Ang aktibidad ng PLA2 ng sea snake venom ay mababa din.
Sa mga nakalipas na taon, hindi naiulat na ang PLA2 sa kamandag ng ahas ay umiiral sa anyo ng aktibong dimer, tulad ng eastern rhombophora rattlesnake (C. snake venom ay naglalaman ng type a at type P PLA2, na parehong binubuo ng dalawang magkaparehong subunits. , at tanging dimerase lang ang mayroon
Aktibidad.Shen et al.iminungkahi din na tanging ang dimer ng PLA2 ng kamandag ng ahas ang aktibong anyo ng enzyme.Ang pag-aaral ng spatial structure ay nagpapatunay din na ang PLA2 ng western diamondback rattlesnake ay umiiral sa anyo ng dimer.Piscivorous compound
Mayroong dalawang magkaibang PLA ^ Ei at E2 ng snake venom, kung saan ang 仏 ay umiiral sa anyo ng dimer, ang dimer ay aktibo, at ang dissociated monomer nito ay hindi aktibo.Lu Yinghua et al.(1980) higit pang pinag-aralan ang pisikal at kemikal na katangian at reaction kinetics ng E. Jayanthi et al.(1989) ihiwalay ang isang pangunahing PLA2 (VRVPL-V) mula sa viper venom.Ang molecular weight ng monomer PLA2 ay 10000, na may nakamamatay, anticoagulant at edema effect.Ang enzyme ay maaaring mag-polymerize ng mga polymer na may iba't ibang mga molekular na timbang sa ilalim ng kondisyon ng PH 4.8, at ang antas ng polymerization at molekular na timbang ng mga polymer ay tumataas sa pagtaas ng temperatura.Ang molekular na timbang ng polimer na nabuo sa 96 ° C ay 53 100, at ang aktibidad ng PLA2 ng polimer na ito ay tumataas ng dalawa
Oras ng post: Nob-18-2022